Увеличение микроскопа для яиц глистов

Микрометрический метод протозоо- и гельминтоскопии

Необходимое оборудование 1. Микроскоп с необходимым набором окуляров и объективов 2. Окуляр-микрометр со шкалой, разделенной на миллиметровые интервалы с дополнительными делениями – штрихами 3. Объект-микрометр (линейка на стекле длиной 1 мм, значение величины одного деления 0,01 мм или 10 мкм)

Подготовка к работе Определить до начала наблюдения значение цены одного деления шкалы окуляр-микрометра для каждой применяемой комбинации объектив—окуляр*. • Поместить объект-микрометр на предметный столик микроскопа и сфокусировать окуляр на линейке объект-микрометра так, чтобы шкала делений стала резкой. • Заменить простой окуляр на окуляр-микрометр, с которым предстоит выполнять измерения объекта, и удостовериться, что деление линеек окуляра и объект-микрометра расположены в одной плоскости. • При малом увеличении объектива совместить шкалы линеек окуляр-микрометра и объект-микрометра параллельно друг под другом. • Выделить (найти) такое положение линеек, где определенное число делений окуляр-микрометра полностью совпадает с целым числом делений объект-микрометра. • Определить цену одного деления окуляр-микрометра: число интервалов на линейке объект-микрометра (У), строго соответствующих целому числу делений окуляр-микрометра, умножить на 10 мкм и затем разделить на число совпадающих делений шкалы окуляр-микрометра (X), т. е, цена одного деления шкалы окуляр-микрометра в данной оптической системе определяется по формуле (10 х У : X). • Аналогичным образом определить цену деления шкалы окуляр-микрометра для всех объективов микроскопа, с которыми предполагается проводить микрометрические исследования, • При особо ответственных исследованиях проверять цену деления окуляр-микрометра при смене объективов даже в пределах одного типа.

Ход измерения объекта • Выбрать соответствующий окуляр и объектив для работы* *. • Сфокусировать систему объектив—окуляр на объекте, который должен быть измерен, • Заменить простой окуляр на окуляр-микрометр. • Определить число делений (интервалов) шкалы окуляр-микрометра, покрывающих длину и (или) ширину измеряемого объекта.

Определить действительный размер объекта путем умножения полученного числа на значение цены деления шкалы окуляр-микрометра при данной системе объектива и окуляра. Примечание. Во избежание необходимости при каждом измерении умножать полученное число на значение цены одного деления окуляр-микрометра можно заранее составить таблицу, в которой вычислены значения 1, 2, 3 и т. д. делений окуляр-микрометра.

Эффективность метода • Метод позволяет осуществлять проведение прямых измерений величины объекта, не требует сложных расчетов, дорогой аппаратуры, доступен для лабораторий разного уровня.

Применение метода • Для уточнения видовой принадлежности паразитарных объектов на основе размера – одного из основных морфофункциональных критериев видовой характеристики паразита. • Дифференциальная диагностика псевдопаразитарных образований.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №5

ТЕМА: ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ГЕЛЬМИНТОЗОВ

Общие положения

Окончательный диагноз гельминтозов может быть установлен только на основании положительных данных лабораторных исследований. Основным методом лабораторной диагностики этих инвазий является обнаружение яиц или личинок гельминтов.

Материалом для исследований служат испражнения, содержимое двенадцатиперстной кишки, кровь, мокрота, биопсированные ткани и другие материалы.

Для лабораторной диагностики гельминтозов необходимо следующее оборудование (как минимум): микроскоп, окулярный микрометр, объект-микрометр, складная и штативная лупы, центрифуга, ареометры, гельминтологические петли, предметные и покровные стекла, целлофановые покровные пластинки по Като, лабораторная посуда (пробирки, цилиндры, воронки разные, флакончики стеклянные на 100 мл, пипетки и др.), штативы для пробирок, палочки стеклянные и деревянные длиной 10-15 см, толщиной 2-3 мм, деревянные шпатели, фильтровальная бумага; оборудование и реактивы для иммунологической диагностики.

Сбор материала для исследования производят в чистую стеклянную или пластмассовую посуду, на которую наклеивают этикетку с указанием необходимых сведений. При массовом обследовании допускается сбор фекалий в стаканчики из парафинированной бумаги и пр.

Испражнения для анализов должны доставляться в лабораторию не позднее одних суток после их выделения, а при подозрении на стронгилоидоз – немедленно. При невозможности доставить фекалии в указанные сроки, их следует смешивать с 2-5-кратным количеством консервирующих жидкостей и хранить до исследования в охлажденном виде.

Для консервирования фекалий в целях сохранения яиц гельминтов применяют следующие консерванты:

– раствор Барбагалло: 5 мл формалина, 100 мл глицерина, 85 мл дистиллированной воды;

– 1-3% раствор моющих средств (детергентов).

– 3% раствор формалина в изотоническом растворе;

– 3% раствор соляной кислоты.

В следующем разделе излагаются наиболее общие методы исследований, применяемые при лабораторной диагностике ряда часто встречающихся гельминтозов . Более специфические методики приводятся при описаниях соответствующих нозоформ.

Гельминтоовоскопия

Исследование кала. Простые методы и методы обогащения. Метод мазка. Деревянной палочкой или спичкой из разных мест доставленной пробы берут комочек кала величиной со спичечную головку и тщательно растирают его на предметном стекле с несколькими каплями 50% раствора глицерина до получения полупрозрачного и равномерного мазка, который занимает почти всю поверхность предметного стекла. Грубые кусочки непереваренной клетчатки удаляют. Обычно мазки просматриваются при малом увеличении микроскопа (7х8) без покровного стекла. Лишь начинающему лаборанту рекомендуется покрывать мазок покровными стеклами, чтобы не запачкать объектив. При необходимости рассмотреть найденное яйцо более детально используют объектив 40х. В правильно приготовленном нативном мазке яйца глистов обычно хорошо видны под малым увеличением микроскопа. Однако их количество во многих случаях не столь значительно, чтобы они содержались в каждом мазке. Просматривать же много мазков из кала каждого обследуемого не представляется возможным, ибо резко возрастает объем работы и снижается ее эффективность. Поэтому разработаны различные методы для того, чтобы повысить концентрацию яиц в исследуемых препаратах. Некоторые из них приводятся ниже.

Метод “толстого” мазка (по Като). Комочек фекалий величиной с горошину наносят на предметное стекло, покрывают специально обработанным влажным целлофаном, прижав его резиновой пробкой к стеклу, что позволяет равномерно распределить фекалии под пленкой.

Предварительная подготовка целлофана: тонкий гидрофильный целлофан нарезают полосками 20 х 40 мм и погружают на сутки в смесь следующего состава: 3% раствор малахитового зеленого -6 мл, глицерин – 500 мл, 6% раствор фенола- 500 мл (в виде исключения можно использовать 50% раствор глицерина без добавления малахитового зеленого и фенола). 100 мл смеси достаточно для обработки 5000 пленок. Целлофановые пленки можно сохранять в такой смеси в закрытой посуде при комнатной температуре неограниченно долго.

Мазок становится пригодным для микроскопирования через 40-60 мин после приготовления.

Метод Калантарян. Основан на том, что яйца гельминтов всплывают в насыщенном растворе соли (флотационный раствор), имеющем большую чем они относительную плотность. Образовавшуюся поверхностную пленку исследуют под микроскопом. Насыщенный раствор нитрата натрия готовят путем смешивания равных объемов соли и воды с последующим кипячением до образования пленки с металлическим оттенком на поверхности. После остывания раствор готов к использованию. Относительная плотность его – 1,4. В растворе всплывают яйца всех гельминтов. Вместо нитрата натрия допустимо использование нитрата аммония. Этот метод намного превосходит по эффективности метод Фюллеборна (флотация яиц в насыщенном растворе поваренной соли) и является одним из наиболее эффективных методов обогащения (флотации).

Для исследования по методу Калантарян комочек фекалий массой 5-10 г вначале тщательно размешивается в небольшом количестве приготовленного раствора, который затем постепенно доливается до тех пор, пока соотношение фекалий и раствора не станет равным 1:10 – 1:20. Размешивание удобнее всего производить деревянным шпателем, который после однократного использования сжигается. После размешивания всплывшие крупные частицы удаляются. К поверхности раствора прикладывается обезжиренное предметное стекло, концы которого лежат на краях стаканчика. Сосуд оставляется на 20-30 мин для отстаивания. По истечении указанного времени стекло с приставшими к нему частицами и жидкостью снимается, переворачивается нижней стороной кверху, помещается на предметное стекло больших размеров (для предохранения от загрязнения столика микроскопа) и микроскопируется. Просматривается вся площадь пленки, прилипшей к поверхности стекла. Во избежание высыхания на препарат можно нанести 2-3 капли 50% раствора глицерина и эмульгировать в нем содержимое пленки.

При другом варианте исследования стаканчик со взвесью фекалий оставляется для отстаивания не накрытый предметным стеклом. Поверхностную пленку снимают гельминтологической петлей, несколько раз прикасаясь к ней и перенося взятые фрагменты на два предметных стекла, а затем микроскопируют как обычно.

Метод Красильникова. Сущность его заключается в том, что яйца гельминтов в фекалиях под действием детергентов в период отстаивания взвеси концентрируются в осадке.

Рабочий раствор моющего средства (детергента) готовится из стирального порошка, предварительно высушенного в сушильном шкафу при 100 о С в течение 1-2 ч. Для приготовления раствора каждый раз подбирается такая максимальная навеска порошка, которая растворяется без осадка. Порция фекалий величиной с лесной орех помещается в фарфоровый или стеклянный стаканчик, в который при тщательном размешивании постепенно доливается 20-30 г раствора детергента. Взвесь оставляется на 1 сутки или центрифугируется в течение 1-2 мин при 1000-1500 об/мин. На дне сосуда образуется трехслойный осадок. Нижний слой содержит тяжелые частицы, средний – более легкие и яйца гельминтов, верхний – наиболее легкие хлопья. Пастеровской пипеткой 1-3 капли содержимого среднего слоя переносят на предметное стекло, покрывают покровным стеклом или целлофановой пленкой и микроскопируют. На одном предметном стекле готовят два препарата.

Метод Горячева. Применяется обычно для выявления тяжелых яиц трематод, которые не всплывают при исследовании кала по методу Фюллеборна. При этом обнаруживаются яйца и других гельминтов. В цилиндр диаметром 1,5-3 см и высотой 20 см наливают 100 мл насыщенного раствора хлористого натрия (или 22% раствора азотнокислого калия). Комочек кала (0,5- 1,0 г) тщательно размешивают в 20-25 мл воды и медленно фильтруют через воронку с двумя слоями марли, наслаивая фильтрат сверху на солевой раствор и избегая перемешивания. Образуются два разграниченных слоя. По мере отстаивания яйца с небольшим количеством частичек кала оседают на дно цилиндра. Через 2-3 часа верхний слой с калом отсасывают пипеткой, а оставшийся солевой раствор оставляют еще на 12-20 часов или центрифугируют. Осадок забирают пипеткой и исследуют под микроскопом.

В.А. Золотухин для массовых обследований предложил проводить отстаивание в центрифужных пробирках, используя небольшие объемы жидкостей. Суспензия кала готовится в 3-4 мл воды, а солевой раствор наливается в центрифужные пробирки в количестве 3-5 мл. В остальном исследование проводится как обычно.

Крупные яйца печеночной двуустки и шистосом в значительном количестве задерживаются на марлевых фильтрах, поэтому для их выявления используют мелкие металлические сетки или мелкоячеистый мельничный газ.

Метод повторного отстаивания. Проба фекалий массой 20-30 г смешивается с 250 мл воды, процеживается через очень мелкую сетку (чулочный трикотаж, мельничный газ) в цилиндр или конический сосуд и отстаивается в течение 30 мин. Затем надосадочная жидкость сливается; до первоначального объема добавляется чистая вода, сосуд встряхивается и смесь снова отстаивается. Процедура повторяется до тех пор, пока верхний слой жидкости не станет прозрачным. После этого из осадка делаются мазки на предметных стеклах и микроскопируются.Метод применяется преимущественно для выявления яиц трематод.

Исследование дуоденального содержимого. В желчи и дуоденальном содержимом могут быть обнаружены яйца гельминтов, находящихся в печени, поджелудочной железе или двенадцатиперстной кишке: яйца различных двуусток, анкилостомид, кишечной угрицы, а также яйца аскарид при извращенной локализации этих паразитов в печени.

Полученный при зондировании субстрат после внешнего осмотра центрифугируется, осадок переносится на предметное стекло и микроскопируется. Если в надосадочной жидкости обнаруживаются хлопья, в которых могут содержаться яйца гельминтов, то исследуется не только осадок, но и эти хлопья. При наличии больших количеств слизи и гноя субстрат перед центрифугированием смешивается с равным объемом эфира.

Исследование мокроты. В мокроте могут быть обнаружены яйца легочной двуустки; очень редко встречаются личинки аскарид, анкилостомид и элементы эхинококкового пузыря (крючья, обрывки оболочки кисты, выводковые капсулы со сколексами). Для их выявления исследуются нативные мазки. В ряде случаев гнойная мокрота смешивается при этом с 0,5% раствором едкого натра или с 25% антиформином. Смесь на 1-1,5 ч помещают в термостат, затем центрифугируют и микроскопируют осадок.

Техника микроскопии яиц и личинок гельминтов

Просмотр препарата при гельминтоовоскопии или выявлении личинок следует начинать при малом увеличении микроскопа (объектив 8х или 10х). Обнаруженные яйца или личинки гельминтов в случае необходимости рассматриваются под большим увеличением. Препарат просматривается полностью; поля зрения последовательно чередуются по горизонтали или в вертикальном направлении. Поле зрения не должно быть слишком ярким, так как на ярко освещенном фоне плохо заметны яйца с тонкой бесцветной и прозрачной оболочкой (яйца остриц, карликового цепня, анкилостомид, кошачьей двуустки и некоторых других гельминтов). Уменьшение степени освещения достигается путем опускания конденсора и регулирования отверстия диафрагмы. Препарат передвигается при помощи препаратоводителя, благодаря чему достигается более высокая степень полноты и последовательности просмотра. При отсутствии препаратоводителя препарат передвигают, держа его за края предметного стекла или за края специальной более широкой стеклянной пластинки, на которую кладут препарат, чтобы не запачкать столик микроскопа.

Для просмотра мазков может быть использован стереоскопический бинокулярный микроскоп (МБС) с окуляром 17, объективом 2. Применение его дает экономию во времени, т.к. он имеет большее поле зрения и большую глубину резкости, чем обычные биологические микроскопы (МБИ). При работе с МБС появляется возможность просматривать большие мазки на стеклах 6х9 см, что увеличивает шансы обнаружения яиц глистов при незначительном их количестве в кале, так как в большом мазке его содержится в 6-10 раз больше, чем в обычном.

В организме человека могут паразитировать различные гельминты, их размеры довольно разнообразны. Одних можно увидеть только под микроскопом, а других даже невооруженным взглядом.

При размножении самка паразита откладывает яйца, обнаружение которых становится достоверным признаком заражения. Яйца гельминтов имеют очень малые размеры и видны только под микроскопом.

Можно ли увидеть глистов без микроскопа

Некоторые гельминты обладают достаточно крупными размерами, их можно обнаружить в кале, на одежде, постельном белье, предметах домашнего обихода. Они имеют либо длинное тонкое тело, либо образуют крупные и тяжелые скопления.